Plasmide CRISPR d'Activation (h) AMPKγ3: sc-403280-ACT

PRKAG3 code la sous-unité régulatrice AMPKγ3 de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), un capteur énergétique central qui intègre l’état AMP/ADP:ATP afin de coordonner l’adaptation métabolique. En modulant l’activation du complexe AMPK et le ciblage de ses substrats, AMPKγ3 influence des voies qui contrôlent la captation du glucose, le métabolisme du glycogène, la fonction mitochondriale et l’homéostasie lipidique via des nœuds en aval tels que mTORC1 et les régulateurs de l’autophagie. Bien que surtout caractérisée dans le muscle strié, une altération de la signalisation AMPK impliquant PRKAG3 est pertinente pour les réponses au stress cellulaire, en lien avec la sensibilité à l’insuline, le remodelage métabolique et des voies de signalisation associées à l’inflammation. Une activité dérégulée de la voie AMPK est fréquemment étudiée dans des contextes tels que les mécanismes des maladies métaboliques et le stress nutritionnel des cellules tumorales, où une régulation dépendante de PRKAG3 peut façonner les phénotypes bioénergétiques.

AMPKγ3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRKAG3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AMPKγ3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRKAG3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRKAG3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AMPKγ3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRKAG3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AMPKγ3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AMPKγ3 dans les cellules tumorales présentant une expression de PRKAG3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.