Plásmido CRISPR de Activación (h) Aminopeptidase A: sc-403989-ACT

ENPEP codifica la aminopeptidasa A (APA), una aminopeptidasa de membrana dependiente de zinc que elimina preferentemente residuos ácidos del extremo N-terminal de péptidos bioactivos. En el sistema renina–angiotensina, la APA contribuye al procesamiento de la angiotensina II e influye en la señalización posterior vinculada al tono vascular y la regulación neuroendocrina, además de desempeñar funciones adicionales en el metabolismo de péptidos en la superficie celular. La expresión de ENPEP es prominente en el riñón y en otros compartimentos epiteliales, donde se relaciona con el procesamiento proteolítico, el tráfico de membrana y la homeostasis local de hormonas peptídicas. La actividad desregulada de la APA o la expresión de ENPEP se ha asociado con alteraciones en la regulación de la presión arterial y con fisiopatología renal, lo que impulsa estudios mecanísticos en modelos celulares relevantes para el riñón y el ámbito cardiometabólico.

Aminopeptidase A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ENPEP sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Aminopeptidase A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ENPEP en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ENPEP, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Aminopeptidase A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ENPEP y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Aminopeptidase A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Aminopeptidase A en células tumorales con expresión de ENPEP silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.