alpha Synuclein CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423051-ACT

Das murine Snca-Gen kodiert Alpha-Synuclein, ein präsynaptisches neuronales Protein, das den Transport synaptischer Vesikel, den Aufbau des SNARE-Komplexes und die Dynamik der Neurotransmitterfreisetzung reguliert. Über Wechselwirkungen mit Lipidmembranen und vesikelassoziierten Proteinen beeinflusst Alpha-Synuclein Proteostase-Wege, darunter die Ubiquitin-Proteasom-Aktivität und die Autophagie-Lysosomen-Funktion, und kann unter zellulärem Stress die mitochondriale Homöostase beeinträchtigen. Eine veränderte Menge, Fehlfaltung und Aggregation von Alpha-Synuclein sind mit Neurodegeneration und Neuroinflammation verknüpft, wodurch Snca ein zentrales Ziel für mechanistische Studien zur neuronalen Signalübertragung und zur Qualitätskontrolle von Proteinen ist. Veränderungen der Snca-Expression werden zudem genutzt, um Signalwege zu untersuchen, die Vesikelrecycling, Reaktionen auf oxidativen Stress und intrazelluläre Proteinaggregation steuern.

alpha Synuclein Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Snca-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

alpha Synuclein Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Snca-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Snca-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen alpha Synuclein-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Snca-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von alpha Synuclein-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des alpha Synuclein-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Snca-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.