Plásmido CRISPR de Activación (m) ALKBH8: sc-426676-ACT

El gen Alkbh8 de ratón codifica ALKBH8, una enzima de modificación de tRNA que respalda la fidelidad de la traducción al catalizar pasos clave en la química de la uridina “wobble”, incluidas la metilación y modificaciones oxidativas que influyen en la decodificación de codones. Mediante la regulación de la eficiencia de decodificación dependiente de tRNA, ALKBH8 afecta la homeostasis proteica y las vías de adaptación celular al estrés, en particular bajo condiciones oxidativas y genotóxicas. La actividad alterada de ALKBH8 se ha relacionado con paisajes desregulados de modificaciones de ARN que pueden influir en la estabilidad del genoma, la señalización de respuesta al estrés y programas de supervivencia celular relevantes para la biología del cáncer y modelos de lesión tisular inflamatoria. Como nodo del control epitranscriptómico de la traducción, Alkbh8 se estudia con frecuencia en el contexto del equilibrio redox, las respuestas al daño del ADN y fenotipos asociados a la proteostasis.

ALKBH8 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Alkbh8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ALKBH8 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Alkbh8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Alkbh8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ALKBH8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Alkbh8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ALKBH8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ALKBH8 en células tumorales con expresión de Alkbh8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.