Plasmide CRISPR d'Activation (h) Aldehyde dehydrogenase 1-A2/ALDH1A2: sc-401340-ACT

ALDH1A2 humain code l’aldéhyde déshydrogénase 1-A2, une rétinaldéhyde déshydrogénase cytosolique qui catalyse l’oxydation du rétinaldéhyde en acide rétinoïque, un morphogène clé contrôlant des programmes transcriptionnels via les récepteurs de l’acide rétinoïque. En régulant le métabolisme des rétinoïdes et l’expression génique dépendante de l’acide rétinoïque, ALDH1A2 influence la mise en place du patron embryonnaire, la différenciation épithéliale et l’homéostasie tissulaire, et s’insère dans des réseaux de signalisation du développement tels que la régulation des gènes HOX. Une activité ou une expression modifiée d’ALDH1A2 peut perturber les gradients d’acide rétinoïque et a été associée à des malformations congénitales ainsi qu’à des changements dépendants du contexte de l’état de différenciation, pertinents pour la biologie du cancer et des maladies fibrosantes. Comme la signalisation de l’acide rétinoïque intègre l’état métabolique au contrôle transcriptionnel, ALDH1A2 constitue un nœud utile pour disséquer les interactions entre voies et les décisions de destin cellulaire.

Aldehyde dehydrogenase 1-A2/ALDH1A2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ALDH1A2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Aldehyde dehydrogenase 1-A2/ALDH1A2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ALDH1A2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ALDH1A2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Aldehyde dehydrogenase 1-A2/ALDH1A2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ALDH1A2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Aldehyde dehydrogenase 1-A2/ALDH1A2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Aldehyde dehydrogenase 1-A2/ALDH1A2 dans les cellules tumorales présentant une expression de ALDH1A2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.