AK2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404166-ACT

Humanes AK2 (Adenylatkinase 2) ist eine Phosphotransferase im Intermembranraum der Mitochondrien, die die Umwandlung von ATP und AMP ineinander katalysiert, um die Homöostase der Adeninnukleotide und die zelluläre Energiebilanz zu regulieren. Durch die Gestaltung lokaler ATP/ADP/AMP-Verhältnisse unterstützt AK2 die mitochondriale oxidative Phosphorylierung und beeinflusst Stoffwechsel-Stressantworten, die mit der AMPK-Signalgebung und der Anfälligkeit für Apoptose verknüpft sind. AK2-Aktivität steht außerdem mit der Biologie hämatopoetischer und immunologischer Zellen in Zusammenhang, wobei der mitochondriale Nukleotidstoffwechsel zu Proliferations- und Differenzierungsprogrammen beiträgt. Eine Fehlregulation oder genetische Veränderung von AK2 wurde mit Immundefizienz und hämatologischen Phänotypen in Verbindung gebracht, was AK2 zu einem nützlichen Knotenpunkt macht, um das Zusammenspiel zwischen mitochondrialem Stoffwechsel und Immunsystem zu untersuchen.

AK2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AK2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AK2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AK2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AK2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AK2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AK2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AK2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AK2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AK2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.