AGPS CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-404604-ACT-2

Das humane AGPS (Alkylglyceronphosphat-Synthase) kodiert ein peroxisomales Enzym, das einen festgelegten („committed“) Schritt in der Biosynthese von Etherphospholipiden (Plasmalogenen) katalysiert, indem es Acyl-Dihydroxyacetonphosphat in Alkyl-Dihydroxyacetonphosphat umwandelt und dadurch die Membranzusammensetzung sowie lipidvermittelte Signalprozesse unterstützt. Die AGPS-Aktivität verknüpft die peroxisomenabhängige Lipidmetabolik mit übergeordneten Signal- und Regulationswegen, die oxidative Stressantworten, Organellenhomöostase und Lipid-Remodeling über Schnittstellen zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien steuern. Eine Störung der AGPS-Funktion wird mit Defekten der Peroxisomenbiogenese und Plasmalogenmangel-Erkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich Phänotypen aus dem Spektrum der rhizomelen Chondrodysplasia punctata, und ist damit ein relevantes Ziel zur Untersuchung von Mechanismen neurodevelopmentaler und skeletaler Pathologien. Geneditierung oder gezielte Perturbation von AGPS eignet sich zur Erzeugung zellulärer Modelle, um peroxisomalen Lipidfluss, plasmalogenabhängige Membrandynamik und nachgeschaltete Effekte auf Zellphysiologie und Stoffwechsel zu analysieren.

AGPS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AGPS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AGPS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AGPS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AGPS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AGPS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AGPS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AGPS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AGPS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AGPS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.