AF-6 CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-404503-ACT-2

Das humane Gen AFDN kodiert das junctionale Gerüstprotein AF-6 (Afadin), einen Multidomänen-Adaptor, der Adhäsionsrezeptoren der Nectin-Familie mit dem Aktin-Zytoskelett verbindet, um Adhärenskontakte zu organisieren und die Barriereintegrität von Epithelien und Endothelien aufrechtzuerhalten. AF-6 koordiniert die Umgestaltung des Zytoskeletts und die Zellpolarität, indem es Signale kleiner GTPasen wie Rap1 und Ras integriert, und trägt so zur Kontaktbildung, kollektiven Migration und Mechanotransduktion in der Gewebemorphogenese bei. Eine fehlregulierte Funktion und Lokalisation von AFDN/AF-6 wurde mit veränderter Zell-Zell-Adhäsion und invasivem Verhalten bei Krebs in Verbindung gebracht, und Varianten, die die Stabilität von Zellkontakten beeinträchtigen, wurden mit neuroentwicklungsbezogenen und vaskulären Phänotypen assoziiert. AFDN wird daher in Geneditierungs- und funktionellen Genomikstudien häufig eingesetzt, um in menschlichen Zellmodellen die Assemblierung von Zellkontakten, Polarisationsnetzwerke und Signal-Crosstalk an Zell-Zell-Kontakten zu untersuchen.

AF-6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AFDN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AF-6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AFDN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AFDN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AF-6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AFDN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AF-6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AF-6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AFDN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.