ADH1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402260-ACT

Humanes ADH1A kodiert die Alkoholdehydrogenase 1A (ADH1), eine zytosolische, zinkabhängige Oxidoreduktase, die die NAD⁺-abhängige Oxidation von Ethanol und anderen kurzkettigen Alkoholen zu den entsprechenden Aldehyden katalysiert. Diese enzymatische Aktivität trägt zum Xenobiotika-Stoffwechsel und zur Retinoid-Homöostase bei, indem sie die gegenseitige Umwandlung von Alkohol- und Aldehyd-Zwischenprodukten beeinflusst, die mit Reaktionen der Aldehyddehydrogenasen verknüpft sind. Die ADH1A-Expression ist vor allem in der Leber und im Gastrointestinaltrakt ausgeprägt, wo sie das zelluläre Redoxgleichgewicht (NADH/NAD⁺) mitprägt und den nachgeschalteten metabolischen Fluss über Aldehyd- und Acetyl‑CoA-gekoppelte Stoffwechselwege beeinflusst. Eine veränderte Regulation oder genetische Variation in Genen des Alkohol-/Aldehydstoffwechsels, einschließlich Mitgliedern der ADH-Familie, ist mit Unterschieden in der Anfälligkeit für alkoholbedingte Gewebeschäden und in der Reaktion auf karzinogene Exposition verbunden, was ADH1A zu einem nützlichen Knotenpunkt für krankheitsmechanistische Studien mit Fokus auf den Stoffwechsel macht.

ADH1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ADH1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ADH1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ADH1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ADH1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ADH1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ADH1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ADH1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ADH1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ADH1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.