ACOT11 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406653-ACT

ACOT11 (Acyl-CoA-Thioesterase 11) kodiert ein lipidspezifisches Stoffwechselenzym, das langkettige Acyl-CoA-Thioester zu freien Fettsäuren und CoA hydrolysiert und dadurch die intrazellulären Acyl-CoA-Pools feinreguliert. Durch die Modulation der Fettsäurenutzung und von Zwischenprodukten der Lipid-Signalgebung ist ACOT11 mit der mitochondrialen und peroxisomalen Lipidverarbeitung, der Energiehomöostase sowie umfassenderen Netzwerken der Fettsäureoxidation und Lipogenese verknüpft. Veränderungen im Acyl-CoA-Gleichgewicht können Reaktionen auf oxidativen Stress und metabolisches Remodeling beeinflussen – Prozesse, die bei Adipositas, Insulinresistenz und mit Fettleber assoziierten Signalwegen häufig gestört sind. Das humane ACOT11 ist daher ein nützliches Ziel für mechanistische Studien zur metabolischen Regulation und zu lipidgetriebenen zellulären Phänotypen.

ACOT11 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ACOT11-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ACOT11 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ACOT11-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ACOT11-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ACOT11-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ACOT11-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ACOT11-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ACOT11-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ACOT11-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.