ABCD2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405099-ACT

ABCD2 kodiert einen peroxisomalen ATP-bindenden Kassettentransporter (ABC), der sehr langkettige Fettsäuren und verwandte Acyl-CoAs in Peroxisomen zum Zwecke der β-Oxidation importiert und damit die zelluläre Lipidhomöostase sowie das Redoxgleichgewicht unterstützt. In humanen Zellen wirkt ABCD2 im Zusammenspiel mit anderen peroxisomalen Transportern, um den Fettsäurekatabolismus, das Remodeling von Membranlipiden und die metabolische Anpassung unter oxidativem oder inflammatorischem Stress zu regulieren. Veränderte peroxisomale Lipidverarbeitung und eine dysregulierte Verstoffwechselung sehr langkettiger Fettsäuren werden mit neurodegenerativen sowie leukodystrophiebezogenen Mechanismen in Verbindung gebracht, was ABCD2 zu einem nützlichen Gen für die Untersuchung kompensatorischer Signal- und Stoffwechselwege in der Peroxisomenbiologie macht. Die Expression und Aktivität von ABCD2 sind außerdem für den mitochondrial–peroxisomalen Crosstalk relevant, einschließlich nachgeschalteter Effekte auf den Energiestoffwechsel und die Lipidsignalisierung.

ABCD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ABCD2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ABCD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ABCD2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ABCD2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ABCD2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ABCD2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ABCD2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ABCD2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ABCD2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.