Plasmide CRISPR d'Activation (h) 20S Proteasome β3: sc-409667-ACT

PSMB3 code la sous-unité β3 du cœur catalytique du protéasome humain 20S, un composant structural du protéasome 26S qui permet le renouvellement, dépendant de l’ATP, des protéines ubiquitinylées. La protéolyse médiée par le protéasome régule le contrôle qualité des protéines, le traitement des antigènes et la progression du cycle cellulaire, et elle s’articule avec des voies contrôlant les réponses au stress, la signalisation des dommages à l’ADN et l’activité de NF-κB. Des perturbations de l’expression des sous-unités du protéasome peuvent remodeler la protéostasie et modifier la dégradation de protéines régulatrices à courte durée de vie, influençant l’apoptose, la prolifération et la signalisation immunitaire. Un fonctionnement dysrégulé du protéasome et une composition altérée de ses sous-unités ont été associés à la biologie des cancers, à la neurodégénérescence et aux physiopathologies inflammatoires, via des effets étendus sur l’homéostasie protéique.

20S Proteasome β3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PSMB3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

20S Proteasome β3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PSMB3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PSMB3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de 20S Proteasome β3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PSMB3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de 20S Proteasome β3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie 20S Proteasome β3 dans les cellules tumorales présentant une expression de PSMB3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.