Plásmido CRISPR de Activación (h) λ-crystallin: sc-412108-ACT

CRYL1 codifica la λ-cristalina, una enzima citosólica dependiente de NADPH con actividad de L-gulonato 3-deshidrogenasa que vincula el metabolismo de los carbohidratos con la homeostasis redox celular. Al modular el uso de NADPH, CRYL1 puede influir en las respuestas al estrés oxidativo y en el flujo metabólico a través de vías conectadas con la red de la vía de las pentosas fosfato y con intermediarios relacionados de ácidos de azúcares. La expresión de CRYL1 se ha estudiado en el contexto de la especialización metabólica específica de tejido y de la adaptación celular a la disponibilidad de nutrientes. La desregulación del control redox y metabólico que involucra procesos asociados a CRYL1 se ha explorado en modelos relevantes de enfermedad en los que el estrés oxidativo y las alteraciones del metabolismo intermediario contribuyen a la patología.

λ-crystallin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CRYL1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

λ-crystallin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CRYL1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CRYL1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de λ-crystallin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CRYL1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de λ-crystallin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía λ-crystallin en células tumorales con expresión de CRYL1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.