Plasmide CRISPR d'Activation (h) γ-sarcoglycan: sc-402275-ACT

SGCG code la γ‑sarcoglycane, un composant central du complexe des sarcoglycanes au sein du complexe de glycoprotéines associé à la dystrophine, qui stabilise la membrane des cellules musculaires pendant la contraction. La γ‑sarcoglycane contribue au couplage entre le cytosquelette et la matrice extracellulaire, soutenant l’intégrité du sarcolemme et la mécanotransduction dans le muscle strié. La perturbation de SGCG altère l’assemblage du complexe des sarcoglycanes et compromet la stabilité membranaire, favorisant des signaux associés aux dommages, une dérégulation de l’homéostasie du calcium et un remodelage dépendant de la réponse au stress. Le dysfonctionnement de SGCG est génétiquement associé à des phénotypes de dystrophie musculaire, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la biologie du complexe dystrophine‑glycoprotéines et des voies de dégénérescence musculaire.

γ-sarcoglycan Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SGCG sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

γ-sarcoglycan Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SGCG dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SGCG, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de γ-sarcoglycan. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SGCG natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de γ-sarcoglycan au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie γ-sarcoglycan dans les cellules tumorales présentant une expression de SGCG silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.