Plasmide CRISPR d'Activation (h) β-TrCP: sc-400971-ACT

BTRC code la protéine humaine à domaine F-box β‑TrCP, une sous-unité de reconnaissance des substrats du complexe ligase E3 d’ubiquitine SCF (SKP1–CUL1–F‑box), qui dirige l’ubiquitination dépendante d’un phosphodégron et la dégradation protéasomale d’un large éventail de protéines régulatrices. Par cette activité, β‑TrCP intègre la signalisation et la protéostasie au sein de voies telles que NF‑κB (via la régulation d’IκB), Wnt/β‑caténine, le contrôle du cycle cellulaire et les réponses aux dommages de l’ADN, contribuant ainsi à façonner les programmes transcriptionnels et l’intégrité des points de contrôle. Une expression altérée de BTRC ou un ciblage aberrant de ses substrats peut perturber la signalisation inflammatoire, la prolifération et la stabilité génomique, des processus fréquemment impliqués dans la biologie du cancer et d’autres mécanismes de maladies complexes. En raison du large spectre de substrats de β‑TrCP, cette protéine est souvent étudiée pour cartographier le remodelage des réseaux médiés par l’ubiquitine et les interactions (cross-talk) entre voies en réponse à des stimuli définis.

β-TrCP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BTRC sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

β-TrCP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BTRC dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BTRC, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de β-TrCP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BTRC natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de β-TrCP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie β-TrCP dans les cellules tumorales présentant une expression de BTRC silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.