β Enolase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400843-ACT

ENO3 kodiert die humane β-Enolase, ein muskelangereichertes glykolytisches Enzym, das die Umwandlung von 2-Phosphoglycerat und Phosphoenolpyruvat katalysiert und so bei hoher metabolischer Belastung die ATP-Produktion unterstützt. Als Bestandteil des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels verknüpft die β-Enolase die Glykolyse mit der übergeordneten Energiehomöostase und kann über die nachgeschaltete Pyruvatverwertung das zelluläre Redoxgleichgewicht beeinflussen. Veränderte ENO3-Expression und ein veränderter glykolytischer Fluss wurden in Zusammenhängen wie Skelettmuskeldysfunktion, metabolischer Umprogrammierung und krankheitsassoziierten Verschiebungen hin zur aeroben Glykolyse untersucht. ENO3 ist daher ein nützlicher Marker und Modulator für Studien, die den Energiestoffwechsel mit zellulären Stressantworten und Differenzierungszuständen verknüpfen.

β Enolase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ENO3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

β Enolase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ENO3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ENO3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen β Enolase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ENO3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von β Enolase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des β Enolase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ENO3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.