Plásmido CRISPR de Activación (m) αENaC: sc-422825-ACT

Scnn1a codifica la subunidad alfa del canal epitelial de sodio del ratón (αENaC), un componente formador del poro necesario para el transporte de Na⁺ sensible a la amilorida a través de membranas epiteliales. αENaC contribuye a la captación apical de sodio, que influye en la homeostasis del líquido de superficie de las vías respiratorias, el aclaramiento de líquido alveolar y el equilibrio electrolítico transepitelial en riñón, pulmón y colon distal. La actividad del canal se integra con la señalización de la aldosterona y el control de apertura dependiente de proteasas, y está modulada por vías de tráfico dependientes de ubiquitina, como la regulación mediada por NEDD4-2. La disfunción de ENaC se utiliza ampliamente como modelo de alteraciones en el manejo de sales y líquidos, vinculando la expresión de Scnn1a con estudios sobre deshidratación de las vías respiratorias, fenotipos de obstrucción por moco y fisiología relacionada con la presión arterial tanto in vivo como en epitelios cultivados.

αENaC El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Scnn1a sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

αENaC El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Scnn1a en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Scnn1a, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de αENaC. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Scnn1a y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de αENaC en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía αENaC en células tumorales con expresión de Scnn1a silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.