ZPK Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404802-ACT

O MAP3K12 humano codifica a ZPK (também conhecida como DLK), uma quinase quinase quinase de MAP quinase que atua a montante das cascatas de MAPK JNK e p38 para regular programas transcricionais responsivos ao estresse. A ZPK integra sinais de lesão axonal, estímulos inflamatórios e perturbações do citoesqueleto para influenciar a diferenciação, a sobrevivência e a degeneração neuronais, com papéis de destaque no sistema nervoso. Por meio da fosforilação de MAP2Ks a jusante, o MAP3K12 ajuda a controlar a apoptose, o crescimento de neuritos e a remodelação sináptica. A desregulação da sinalização da ZPK tem sido associada à neurodegeneração e à biologia da dor neuropática, tornando o MAP3K12 um alvo útil para dissecar a sinalização de estresse mediada por quinases em modelos celulares humanos.

ZPK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MAP3K12 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ZPK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MAP3K12 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MAP3K12, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ZPK. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MAP3K12 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ZPK no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ZPK em células tumorais com expressão de MAP3K12 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.