Y14 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403255-ACT

RBM8A kodiert das menschliche RNA-bindende Protein Y14, einen Kernbestandteil des Exon-Junction-Complex (EJC), der nach dem Spleißen auf mRNA abgelagert wird und nachgelagerte Prozesse des RNA-Stoffwechsels koordiniert. Y14 ist an der nonsense-vermittelten mRNA-Degradation (NMD), dem mRNA-Export und der Regulation der Translation beteiligt und beeinflusst damit die Qualitätskontrolle von Transkripten sowie die Homöostase der Genexpression. Über diese Funktionen wirkt RBM8A auf Signalwege ein, die mit Zellzyklusprogression, entwicklungsbezogener Genregulation und stressabhängiger RNA-Prozessierung verknüpft sind. Eine Fehlregulation der EJC-Aktivität und der RBM8A-assoziierten RNA-Überwachung wurde mit aberrantem Spleißen und veränderter Transkriptstabilität in mehreren krankheitsrelevanten Kontexten in Verbindung gebracht, darunter neuroentwicklungsbezogene und krebsassoziierte Genexpressionsprogramme.

Y14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RBM8A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Y14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RBM8A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RBM8A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Y14-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RBM8A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Y14-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Y14-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RBM8A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.