Plasmide CRISPR d'Activation (m) Wee 1: sc-423702-ACT

Wee1 code la protéine kinase WEE1, un régulateur conservé du point de contrôle G2/M en réponse aux dommages de l’ADN, qui freine l’entrée en mitose par phosphorylation inhibitrice de CDK1, coordonnant l’achèvement de la phase S, les réponses au stress de réplication et l’intégrité du génome. Dans les cellules murines, WEE1 intègre des signaux provenant d’ATR/CHK1 et d’autres voies de checkpoint afin de moduler la dynamique du cycle cellulaire, de stabiliser les fourches de réplication bloquées et de limiter l’accumulation de cassures double brin de l’ADN. La perturbation de l’activité de Wee1 modifie la prolifération, la stabilité chromosomique et les programmes d’apoptose, ce qui en fait une cible largement utilisée pour étudier le stress de réplication, l’adaptation aux checkpoints et des phénotypes de type « catastrophe mitotique ». Une signalisation WEE1 dérégulée est fréquemment examinée dans le contexte de l’accélération du cycle cellulaire induite par des oncogènes et des dépendances vis-à-vis des voies de réparation de l’ADN, soutenant des recherches mécanistiques en biologie du cancer et en maintenance du génome.

Wee 1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Wee1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Wee 1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Wee1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Wee1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Wee 1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Wee1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Wee 1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Wee 1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Wee1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.