WDFY2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401972-ACT

WDFY2 (WD-repeat- und FYVE-Domäne enthaltend 2) kodiert ein endosomales Protein, das über seine FYVE-Domäne an Phosphatidylinositol-3-phosphat bindet und als Gerüstprotein an der Organisation früher Endosomen sowie der Sortierung von Fracht beteiligt ist. Durch die Regulation des endozytotischen Transports und die Kompartimentierung von Signalprozessen kann WDFY2 Signalweg-Ausgänge beeinflussen, die mit Rezeptorumsatz und der Dynamik PI3K-assoziierter Signalgebung verknüpft sind. Eine veränderte WDFY2-Expression oder -Funktion wurde mit Fehlregulationen des vesikulären Transports in Verbindung gebracht und in Studien zu krebsassoziierter Zellmigration, Wachstumsfaktorsignalgebung und metabolischer Regulation beschrieben, was seine Bedeutung als Knotenpunkt unterstreicht, der Endosomenbiologie mit Krankheitsmechanismen verknüpft.

WDFY2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen WDFY2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

WDFY2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des WDFY2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der WDFY2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen WDFY2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native WDFY2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von WDFY2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des WDFY2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem WDFY2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.