Plasmide CRISPR d'Activation (h) Waf1/Cip1/CDKN1A p21: sc-400013-ACT

CDKN1A code l’inhibiteur de kinases cycline‑dépendantes p21 (Waf1/Cip1), un effecteur central de la signalisation de p53 qui freine l’activité de CDK2/CDK1 afin d’imposer les points de contrôle du cycle cellulaire G1/S et G2/M. p21 intègre des signaux de dommages à l’ADN, de stress oxydatif et de signalisation oncogénique pour coordonner l’arrêt du cycle cellulaire, la réparation de l’ADN, la sénescence et une apoptose dépendante du contexte. Par ses interactions avec PCNA et les complexes cycline–CDK, il module la dynamique de la réplication et la stabilité du génome, reliant le contrôle des checkpoints aux réponses au stress de réplication. Une expression dérégulée de CDKN1A est largement associée à la tumorigenèse et à des phénotypes de résistance aux thérapies, et elle est également pertinente pour l’inflammation et les programmes de sénescence cellulaire associés au vieillissement.

Waf1/Cip1/CDKN1A p21 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CDKN1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Waf1/Cip1/CDKN1A p21 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CDKN1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CDKN1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Waf1/Cip1/CDKN1A p21. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CDKN1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Waf1/Cip1/CDKN1A p21 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Waf1/Cip1/CDKN1A p21 dans les cellules tumorales présentant une expression de CDKN1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.