Waf1/Cip1/CDKN1A p21 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400013-ACT

CDKN1A codifica o inibidor de quinases dependentes de ciclina p21 (Waf1/Cip1), um efetor central da sinalização de p53 que restringe a atividade de CDK2/CDK1 para impor os pontos de verificação do ciclo celular em G1/S e G2/M. O p21 integra sinais de dano ao DNA, estresse oxidativo e sinalização oncogênica para coordenar a parada do ciclo celular, o reparo do DNA, a senescência e a apoptose dependente do contexto. Por meio de interações com PCNA e complexos ciclina–CDK, ele modula a dinâmica da replicação e a estabilidade do genoma, conectando o controle de checkpoints às respostas ao estresse de replicação. A expressão desregulada de CDKN1A está amplamente associada à tumorigênese e a fenótipos de resistência a terapias, sendo também relevante para inflamação e para programas de senescência celular associados ao envelhecimento.

Waf1/Cip1/CDKN1A p21 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CDKN1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Waf1/Cip1/CDKN1A p21 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CDKN1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CDKN1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Waf1/Cip1/CDKN1A p21. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CDKN1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Waf1/Cip1/CDKN1A p21 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Waf1/Cip1/CDKN1A p21 em células tumorais com expressão de CDKN1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.