VAP-A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403093-ACT

VAPA codifica a proteína associada à proteína de membrana associada a vesículas A (VAP-A), um adaptador residente no retículo endoplasmático (RE) que organiza sítios de contato entre membranas e coordena a troca de lipídios, o tráfego vesicular e a comunicação entre organelas. A VAP-A liga-se a parceiros que contêm o motivo FFAT para regular a homeostase de fosfoinositídeos e esteróis, sustentando o transporte RE–Golgi, a dinâmica de endossomos e a sinalização RE–mitocôndria. Por meio desses processos, a VAP-A influencia a proteostase, a autofagia e respostas ao estresse que moldam o metabolismo e a sobrevivência celulares. A desregulação da biologia dos sítios de contato ligada a VAPA tem sido implicada em neurodegeneração e outros distúrbios associados a alterações no manuseio de lipídios e ao estresse do RE, tornando-o um ponto útil para estudos mecanísticos da organização de membranas.

VAP-A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VAPA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VAP-A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VAPA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VAPA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VAP-A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VAPA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VAP-A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VAP-A em células tumorais com expressão de VAPA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.