Vangl2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-430058-ACT

Vangl2 (Van-Gogh-ähnlich 2) kodiert eine zentrale Komponente des Planar-Cell-Polarity-(PCP-)Signalwegs, der während der Mausentwicklung polarisierte Zellverhaltensweisen über Gewebe hinweg koordiniert. Als Vierfach-Transmembranprotein trägt Vangl2 dazu bei, asymmetrische PCP-Komplexe mit Partnern wie Frizzled/Dishevelled und Prickle zu organisieren, und beeinflusst dadurch konvergente Extension, orientierte Zellteilung und kollektive Migration. Die Vangl2-abhängige Signalübertragung überschneidet sich mit nicht-kanonischen Wnt-Signalwegen und reguliert so Zytoskelettdynamik und Gewebemorphogenese. Eine fehlregulierte Vangl2-Funktion ist mit PCP-Defekten und Entwicklungsphänotypen einschließlich Störungen des Neuralrohrverschlusses verbunden und macht Vangl2 zu einem nützlichen Ziel, um polarisationsgetriebene Prozesse zu untersuchen.

Vangl2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Vangl2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Vangl2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Vangl2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Vangl2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Vangl2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Vangl2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Vangl2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Vangl2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Vangl2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.