Vangl2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400805-ACT

VANGL2 kodiert Vangl2, eine zentrale Komponente der planar cell polarity (PCP), die während der Entwicklung und in adulten Epithelien dazu beiträgt, gerichtete Zellverhaltensweisen und die Gewebearchitektur zu koordinieren. Vangl2 ist an der nicht-kanonischen WNT/PCP-Signalübertragung beteiligt und beeinflusst über Interaktionen mit Dishevelled sowie nachgeschaltete RhoA/ROCK- und JNK-Signalwege die Umgestaltung des Zytoskeletts, polarisierte Migration und gerichtete Zellteilung. Eine veränderte Regulation von VANGL2 wurde mit Defekten der konvergenten Extension und des Neuralrohrschlusses in Verbindung gebracht, und eine fehlregulierte PCP-Signalgebung wird häufig mit Veränderungen der epithelialen Organisation assoziiert, die für die Krebsbiologie und neuroentwicklungsbedingte Störungen relevant sind. Als Determinante der Polarität wird Vangl2 außerdem in Zusammenhängen wie Ziliogenese, Integrität von Zell-Zell-Kontakten und kollektiver Zellmigration untersucht.

Vangl2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen VANGL2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Vangl2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des VANGL2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der VANGL2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Vangl2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native VANGL2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Vangl2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Vangl2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem VANGL2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.