Plásmido CRISPR de Activación (h) VAMP-1: sc-401607-ACT

VAMP1 codifica la proteína de membrana asociada a vesículas 1 (VAMP-1), un componente SNARE de la familia sinaptobrevina que media el acoplamiento de las vesículas sinápticas y la fusión de membranas necesaria para la liberación de neurotransmisores desencadenada por Ca2+. VAMP-1 participa en las vías centrales de exocitosis presináptica mediante la formación de complejos SNARE con sintaxinas y SNAP-25, lo que favorece un ciclo vesicular rápido y la transmisión sináptica. La alteración de la fusión vesicular dependiente de VAMP1 perturba la comunicación neuronal y se ha relacionado con fenotipos de tipo neurodesarrollativo y neuromuscular, por lo que es relevante para estudiar la disfunción sináptica. En modelos celulares humanos, la regulación de VAMP1 también es útil para investigar la dinámica del tráfico de membranas y la secreción dependiente de la actividad.

VAMP-1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de VAMP1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

VAMP-1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus VAMP1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional VAMP1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de VAMP-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo VAMP1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de VAMP-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía VAMP-1 en células tumorales con expresión de VAMP1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.