USF-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401713-ACT

USF2 umano (upstream stimulatory factor 2) codifica USF-2, un fattore di trascrizione basic helix–loop–helix con “leucine zipper” che si lega ai motivi E-box per coordinare programmi di espressione genica che controllano proliferazione, differenziamento, metabolismo e risposte cellulari allo stress. USF-2 partecipa alla regolazione trascrizionale a valle della segnalazione collegata alle MAPK e interagisce con i complessi di modificazione della cromatina per modulare l’attività dei promotori in diversi tipi cellulari. Un’attività disfunzionale di USF2 è stata associata ad alterazioni del controllo del ciclo cellulare, alla riprogrammazione metabolica e a stati trascrizionali infiammatori descritti in contesti di cancro e di malattie cardiometaboliche. Queste caratteristiche rendono USF-2 un nodo utile per studi meccanicistici delle reti trascrizionali e del crosstalk tra vie di segnalazione.

USF-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di USF2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

USF-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus USF2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione USF2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di USF-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus USF2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da USF-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via USF-2 nelle cellule tumorali con espressione di USF2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.