Plasmide CRISPR d'Activation (h) URE-B1: sc-404890-ACT

HUWE1 code URE-B1, une ligase E3 de type HECT de l’ubiquitine qui régule l’homéostasie protéique en catalysant le transfert d’ubiquitine vers divers substrats impliqués dans la progression du cycle cellulaire, la signalisation des dommages à l’ADN, l’apoptose et les réponses au stress. En contrôlant le renouvellement dépendant de l’ubiquitine, HUWE1 influence des voies liées à la dynamique de la chromatine, aux réseaux associés à MYC et à p53, ainsi qu’aux points de contrôle du stress mitochondrial et du stress protéotoxique. Une activité ou une expression altérée de HUWE1 a été associée à une prolifération dérégulée et à une atteinte de l’intégrité du génome, et des variations génétiques de HUWE1 ont été rapportées dans des contextes de neurodéveloppement et liés au cancer. En tant que nœud central de la signalisation par l’ubiquitine, URE-B1 est fréquemment étudiée pour disséquer l’ubiquitination spécifique des substrats et les interactions entre voies de signalisation dans les cellules humaines.

URE-B1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HUWE1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

URE-B1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HUWE1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HUWE1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de URE-B1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HUWE1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de URE-B1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie URE-B1 dans les cellules tumorales présentant une expression de HUWE1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.