TRPM4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402176-ACT

TRPM4 kodiert einen Ca2+-aktivierten, monovalenten Kationenkanal, der Na+ und K+ leitet und dadurch die Plasmamembran depolarisiert, ohne Ca2+ direkt zu transportieren. Durch die Beeinflussung des Membranpotenzials moduliert TRPM4 den Ca2+-Einstrom über store-operated Kanäle und wirkt auf nachgeschaltete Ca2+-abhängige Signalwege ein, darunter NFAT und weitere Transkriptionsprogramme, die Erregbarkeit, Sekretion und Zellmotilität steuern. Die TRPM4-Aktivität wird mit der Regulation der kardialen Erregungsleitung und des Gefäßtonus in Verbindung gebracht und trägt zur Aktivierung von Immunzellen sowie zu inflammatorischer Signalgebung in myeloiden und lymphoiden Zellpopulationen bei. Eine fehlregulierte TRPM4-Expression oder Kanalfunktion ist mit arrhythmogenen Mechanismen, neuroinflammatorischen Reaktionen und veränderten Proliferationsphänotypen assoziiert, die für Onkologie- und Gewebe-Remodeling-Studien relevant sind.

TRPM4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRPM4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRPM4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRPM4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRPM4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRPM4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRPM4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRPM4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRPM4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRPM4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.