TRAC-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409980-ACT

RNF125 kodiert TRAC-1, eine RING-Typ-E3-Ubiquitin-Ligase, die die Immun-Signalübertragung moduliert, indem sie den ubiquitinierungsabhängigen Abbau wichtiger Proteine in Signalwegen des T‑Zell-Rezeptors sowie in Zytokin-Antwortwegen reguliert. Über die Kontrolle von Proteinstabilität und Signalstärke beeinflusst TRAC‑1 die Aktivierung von Lymphozyten, antivirale Antworten und entzündliche Genprogramme nachgeschaltet zu Signalwegen wie NF‑κB und interferonassoziierter Signalgebung. Eine veränderte Expression oder Funktion von RNF125 wurde mit Immunfehlregulation und krebsassoziierten Immunphänotypen in Verbindung gebracht, was RNF125 für das Studium von Mechanismen der Immunüberwachung und von Tumor‑Immun‑Interaktionen relevant macht. In menschlichen Zellmodellen wird RNF125 häufig untersucht, um die Kontrolle von Signalschwellen und linienspezifischen Transkriptionszuständen durch das Ubiquitin‑Proteasom‑System zu verstehen.

TRAC-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RNF125-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRAC-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RNF125-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RNF125-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRAC-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RNF125-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRAC-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRAC-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RNF125-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.