TP1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404178-ACT

O TEP1 humano codifica a proteína 1 associada à telomerase (TP1), um componente central da telomerase e da maquinaria de manutenção dos telômeros, que sustenta a proteção das extremidades cromossômicas e a capacidade replicativa a longo prazo. A TP1 contribui para a montagem/estabilidade do RNP da telomerase e conecta a biologia dos telômeros a vias de integridade do genoma, incluindo sinalização de dano ao DNA e controle do ciclo celular. A desregulação de fatores associados à telomerase e da homeostase dos telômeros está implicada em fenótipos relacionados ao envelhecimento e em múltiplos contextos de doença caracterizados por instabilidade genômica. Assim, o TEP1 é estudado em modelos de estresse proliferativo, senescência e mudanças nos programas transcricionais impulsionadas por telômeros.

TP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TEP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TEP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TEP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TP1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TEP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TP1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TP1 em células tumorais com expressão de TEP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.