Plásmido CRISPR de Activación (h) Topo IIIα: sc-404439-ACT

TOP3A codifica la ADN topoisomerasa IIIα, una topoisomerasa de tipo IA que resuelve el estrés topológico del ADN y los intermediarios de recombinación durante la replicación y la reparación. La Topo IIIα actúa junto con la helicasa BLM, RMI1 y RMI2 en el complejo BTRR para disolver uniones de Holliday dobles y suprimir eventos de entrecruzamiento aberrantes, promoviendo así la estabilidad del genoma. Gracias a sus funciones en la recombinación homóloga, el reinicio de las horquillas de replicación y la decatenación de ADN entrelazado, TOP3A ayuda a mantener una segregación cromosómica adecuada y el mantenimiento del ADN mitocondrial. La alteración de esta red se asocia con un aumento de los intercambios entre cromátidas hermanas y con fenotipos de inestabilidad genómica relevantes para la biología del cáncer y para trastornos hereditarios del mantenimiento del genoma.

Topo IIIα El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TOP3A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Topo IIIα El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TOP3A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TOP3A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Topo IIIα. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TOP3A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Topo IIIα en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Topo IIIα en células tumorales con expresión de TOP3A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.