Topo IIIα CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404439-ACT

TOP3A kodiert die DNA-Topoisomerase IIIα, eine Topoisomerase vom Typ IA, die DNA-topologischen Stress sowie Rekombinationszwischenprodukte während der Replikation und Reparatur auflöst. Topo IIIα wirkt zusammen mit der BLM-Helikase, RMI1 und RMI2 im BTRR-Komplex, um doppelte Holliday-Junctions zu dissolvieren und aberrante Crossover-Ereignisse zu unterdrücken, wodurch die Genomstabilität gefördert wird. Durch seine Funktionen in der homologen Rekombination, beim Neustart von Replikationsgabeln und bei der Dekatenierung verknäuelter DNA trägt TOP3A zur korrekten Chromosomensegregation und zur Aufrechterhaltung der mitochondrialen DNA bei. Störungen dieses Netzwerks stehen mit erhöhten Schwesterchromatidaustauschen und Phänotypen genomischer Instabilität in Zusammenhang, die für die Krebsbiologie und erbliche Störungen der Genomerhaltung relevant sind.

Topo IIIα Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TOP3A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Topo IIIα Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TOP3A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TOP3A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Topo IIIα-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TOP3A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Topo IIIα-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Topo IIIα-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TOP3A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.