TMEM97 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-411997-ACT

TMEM97 kodiert ein kleines, multipassiges Transmembranprotein, das auch als Sigma-2-Rezeptor bekannt ist. Es ist in Membranen des endoplasmatischen Retikulums sowie in lysosomalen/endosomalen Membranen angereichert und wird mit der intrazellulären Cholesterinverarbeitung und dem Membrantransport in Verbindung gebracht. TMEM97 wurde mit der Regulation der Sterolverteilung verknüpft, unter anderem durch Interaktionen mit Lipidtransport- und Rezeptorkomplexen, wodurch es die Vesikeldynamik und zelluläre Stressantworten beeinflusst. Eine veränderte TMEM97-Expression wurde in proliferativen und neurodegenerativen Kontexten beschrieben, in denen Störungen der Lipidhomöostase, oxidativer Stress und Proteostase zu krankheitsassoziierten Phänotypen beitragen können. Diese Eigenschaften machen TMEM97 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien zu lipidregulierter Signalgebung, Organellenfunktion und Übergängen zwischen Zellzuständen.

TMEM97 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TMEM97-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TMEM97 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TMEM97-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TMEM97-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TMEM97-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TMEM97-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TMEM97-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TMEM97-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TMEM97-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.