TMEM5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-411455-ACT

TMEM5 kodiert ein Transmembranprotein, das an der Glykosylierung von α‑Dystroglykan beteiligt ist – einer Modifikation, die für die korrekte Bindung an die extrazelluläre Matrix und die Integrität der Zellmembran erforderlich ist. Über seine Funktion im Dystroglykan‑Glykosylierungsweg trägt TMEM5 zur Zelladhäsion und zur Gewebearchitektur bei, insbesondere in neuromuskulären Systemen. Eine Störung der TMEM5‑Funktion wird mit Dystroglykanopathien in Verbindung gebracht, einer Krankheitsgruppe, die durch eine fehlerhafte Glykosylierung von α‑Dystroglykan sowie damit assoziierte Entwicklungs- und Muskelpathologien gekennzeichnet ist. Entsprechend ist TMEM5 für mechanistische Studien zur glykanabhängigen Rezeptorbiologie und zu membranassoziierten Glykosylierungsnetzwerken von Interesse.

TMEM5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TMEM5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TMEM5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TMEM5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TMEM5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TMEM5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TMEM5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TMEM5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TMEM5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TMEM5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.