TEF-5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403417-ACT

Humanes TEAD3 kodiert den Transkriptionsfaktor TEF-5, ein DNA-bindendes Protein mit TEA/ATTS-Domäne, das mit den Koaktivatoren YAP/TAZ zusammenwirkt, um Genprogramme zu regulieren, die Proliferation, Linienfestlegung und Gewebewachstum steuern. TEF-5 agiert innerhalb des Hippo-Signalnetzwerks und integriert mechanische Signale sowie Zell-Zell-Kontakt, um transkriptionelle Outputs wie die Umgestaltung der extrazellulären Matrix und die Zellzyklusprogression zu modulieren. Eine fehlregulierte TEAD–YAP/TAZ-Transkriptionsaktivität wird mit onkogenen Phänotypen, fibroseassoziierten Signalwegen und veränderten Entwicklungsprogrammen in Verbindung gebracht, wodurch TEAD3 ein nützliches Ziel für mechanistische Studien der Transkriptionskontrolle darstellt. Expression und Aktivität von TEAD3 sind daher relevant, um kontextabhängige Genregulation in der Krebsbiologie, der Organentwicklung und bei Zellzustandsübergängen zu untersuchen.

TEF-5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TEAD3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TEF-5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TEAD3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TEAD3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TEF-5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TEAD3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TEF-5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TEF-5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TEAD3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.