Plásmido CRISPR de Activación (h) Strumpellin: sc-402808-ACT

WASHC5 codifica Strumpellin, una subunidad esencial del complejo WASH que regula la nucleación de actina dependiente de Arp2/3 en los endosomas para controlar la remodelación de membranas, la tubulación endosomal y la clasificación del cargamento de receptores. A través de su papel en el reciclaje de endosomas a la membrana plasmática y en el tráfico asociado al retromero, Strumpellin influye en la disponibilidad de receptores de señalización, la organización del citoesqueleto y la motilidad celular. La alteración de la dinámica endosomal dependiente de WASHC5 se ha vinculado a fenotipos neurodegenerativos, incluida la paraplejía espástica hereditaria, lo que subraya su relevancia para el mantenimiento neuronal y la integridad axonal. Por tanto, la función de Strumpellin es de interés para estudiar la homeostasis endolisosomal, la dinámica de membranas impulsada por actina y la regulación de vías de señalización dependiente del tráfico.

Strumpellin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de WASHC5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Strumpellin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus WASHC5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional WASHC5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Strumpellin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo WASHC5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Strumpellin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Strumpellin en células tumorales con expresión de WASHC5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.