SphK1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423102-ACT

Sphk1 codifica a esfingosina quinase 1 (SphK1), uma quinase lipídica citosólica que fosforila a esfingosina para gerar esfingosina-1-fosfato (S1P), um potente mediador lipídico bioativo. Ao alterar o equilíbrio ceramida/esfingosina/S1P, a SphK1 influencia a sobrevivência celular, a proliferação, a migração e as respostas ao stress, e interage com o metabolismo dos esfingolípidos, a sinalização de S1P mediada por GPCRs e cascatas inflamatórias. A atividade da SphK1 tem sido associada à regulação do tráfego de células vasculares e imunitárias, a programas angiogénicos e à produção de citocinas, por meio de vias que incluem MAPK/ERK, PI3K/AKT e sinalização de NF-κB. A sinalização SphK1/S1P desregulada é frequentemente estudada em contextos como inflamação, fibrose, disfunção metabólica e fenótipos associados ao cancro em modelos murinos.

SphK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Sphk1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SphK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Sphk1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Sphk1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SphK1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Sphk1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SphK1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SphK1 em células tumorais com expressão de Sphk1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.