SphK1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423102-ACT

Sphk1 kodiert die Sphingosin-Kinase 1 (SphK1), eine zytosolische Lipidkinase, die Sphingosin phosphoryliert und dadurch Sphingosin-1-phosphat (S1P) erzeugt, einen potenten bioaktiven Lipidmediator. Durch die Verschiebung des Ceramid/Sphingosin/S1P-Gleichgewichts beeinflusst SphK1 Zellüberleben, Proliferation, Migration und Stressantworten und ist in den Sphingolipidstoffwechsel, die GPCR-vermittelte S1P-Signalübertragung sowie entzündliche Signalkaskaden eingebunden. Die Aktivität von SphK1 wurde mit der Regulation des vaskulären und immunologischen Zell-Traffickings, angiogenen Programmen und der Zytokinproduktion in Verbindung gebracht – über Signalwege wie MAPK/ERK, PI3K/AKT und NF-κB. Eine Fehlregulation der SphK1/S1P-Signalgebung wird in Mausmodellen häufig in Zusammenhängen wie Entzündung, Fibrose, metabolischer Dysfunktion und krebsassoziierten Phänotypen untersucht.

SphK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Sphk1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SphK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Sphk1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Sphk1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SphK1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Sphk1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SphK1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SphK1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Sphk1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.