Plasmide CRISPR d'Activation (h) SNAT3: sc-403696-ACT

SLC38A3 code pour le transporteur d’acides aminés neutres couplé au sodium SNAT3 (système N), un transporteur de la membrane plasmique qui assure le transport dépendant du Na+ de la glutamine, de l’asparagine, de l’histidine et de substrats apparentés. SNAT3 contribue au transfert de l’azote, à l’anaplérose et à la signalisation dépendante des acides aminés en régulant la disponibilité intracellulaire de glutamine et son échange à travers les barrières épithéliales et parenchymateuses, avec notamment des rôles décrits dans le foie, le rein et le couplage métabolique glial. Par son impact sur les flux de glutamine, SNAT3 s’inscrit au carrefour de voies qui contrôlent la gestion de l’ammoniac, l’homéostasie acido-basique et la détection des nutriments liée à mTORC1. Le dérèglement du transport des acides aminés et les altérations du métabolisme de la glutamine sont fréquemment étudiés dans des contextes tels que le stress métabolique, les neurosciences et l’adaptation nutritionnelle des cellules tumorales, ce qui fait de SLC38A3 une cible utile pour des études mécanistiques sur le remodelage médié par les transporteurs.

SNAT3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC38A3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SNAT3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC38A3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC38A3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SNAT3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC38A3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SNAT3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SNAT3 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC38A3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.