Plasmide CRISPR d'Activation (h) SMO/Smoothened: sc-400491-ACT

SMO (Smoothened) est un transducteur de signal à sept domaines transmembranaires de la voie Hedgehog, qui relaie les signaux de PTCH1 vers les facteurs de transcription GLI situés en aval. Après stimulation par le ligand Hedgehog, SMO s’accumule dans les cils primaires et favorise des programmes transcriptionnels qui contrôlent la morphogenèse embryonnaire, le maintien des cellules souches/progénitrices et les décisions de destinée cellulaire. L’activité de SMO s’intègre aux voies cAMP/PKA, à la répression médiée par SUFU et au trafic dépendant de la ciliogenèse, afin de moduler la sortie de la voie. Une signalisation SMO aberrante est impliquée dans des défauts du développement et dans la dérégulation oncogénique de la voie Hedgehog, ce qui en fait un nœud clé à explorer dans des modèles cellulaires humains.

SMO/Smoothened Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SMO sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SMO/Smoothened Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SMO dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SMO, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SMO/Smoothened. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SMO natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SMO/Smoothened au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SMO/Smoothened dans les cellules tumorales présentant une expression de SMO silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.