Smad5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400443-ACT

SMAD5 codifica a Smad5, uma SMAD regulada por receptor que transduz sinais de BMP a jusante de recetores de serina/treonina quinase do tipo I/II. Após fosforilação, a Smad5 forma complexos com a SMAD4 e acumula-se no núcleo para regular programas de transcrição que controlam o padrão embrionário, a diferenciação osteogénica e vascular e a homeostase dos tecidos. A sinalização BMP/SMAD mediada por SMAD5 interage com redes de desenvolvimento e diferenciação e pode modular a expressão de genes do ciclo celular e de especificação de linhagem, dependendo do contexto celular. A desregulação da sinalização BMP–SMAD, incluindo alterações na atividade da SMAD5, está implicada em malformações congénitas e tem sido investigada em alterações de diferenciação associadas a doenças, em estados transcricionais relacionados com fibrose e na biologia tumoral.

Smad5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SMAD5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Smad5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SMAD5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SMAD5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Smad5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SMAD5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Smad5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Smad5 em células tumorais com expressão de SMAD5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.