Plásmido CRISPR de Activación (h) SKRP1: sc-410316-ACT

DUSP19 codifica SKRP1, una fosfatasa de doble especificidad que modula la fosforilación de serina/treonina y tirosina para ajustar la señalización sensible al estrés. SKRP1 se ha vinculado con la regulación de la dinámica de la vía MAPK, incluido el diálogo cruzado con las cascadas de JNK y p38 que configuran programas transcripcionales que controlan la proliferación, la apoptosis y la adaptación celular al estrés ambiental. A través de su función en la desfosforilación de intermediarios de señalización, DUSP19 contribuye a la homeostasis de la fosforilación que influye en la función mitocondrial y en las salidas de señalización inflamatoria. En la literatura, la expresión o actividad alteradas de DUSP19 se han asociado con una señalización de estrés desregulada observada en diversos contextos relevantes para enfermedades, lo que respalda su uso como un nodo mecanístico para estudios centrados en vías en células humanas.

SKRP1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DUSP19 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SKRP1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DUSP19 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DUSP19, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SKRP1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DUSP19 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SKRP1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SKRP1 en células tumorales con expresión de DUSP19 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.