SK1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403325-ACT

KCNN1 kodiert den humanen kleinleitenden Ca2+-aktivierten K+-Kanal SK1, einen spannungsunabhängigen Kanal, der intrazelluläre Ca2+-Dynamiken mit der Hyperpolarisation der Membran koppelt. Durch die Formung der Nachhyperpolarisation und von Ca2+-Signalmikrodomänen beeinflusst SK1 die neuronale Erregbarkeit, die synaptische Integration sowie die Stimulus‑Sekretions‑Kopplung in erregbaren Zellen. Die KCNN1-Aktivität greift in Ca2+/Calmodulin‑abhängige Prozesse ein, die Feuermuster, Plastizität und nachgeschaltete transkriptionelle Antworten regulieren. Veränderte Funktion und Expression von SK‑Kanälen wurden im Kontext neurophysiologischer Dysregulation und damit verbundener krankheitsrelevanter Phänotypen untersucht, was ihren Nutzen für mechanistische Studien erregbarkeitsgekoppelter Signalwege unterstreicht.

SK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KCNN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KCNN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KCNN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SK1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KCNN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SK1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SK1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KCNN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.