SCOT Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404705-ACT

O OXCT1 humano codifica a succinil‑CoA:3‑oxoácido CoA transferase (SCOT), uma enzima mitocondrial que catalisa a etapa limitante da utilização de corpos cetónicos, convertendo o acetoacetato em acetoacetil‑CoA para entrada no metabolismo do acetil‑CoA e do ciclo do TCA (ciclo do ácido tricarboxílico). A atividade da SCOT liga a cetólise à bioenergética celular, ao equilíbrio redox e à flexibilidade metabólica em tecidos que oxidam corpos cetónicos durante o jejum ou em situações de elevada demanda energética. A função do OXCT1 está integrada com a oxidação de ácidos gordos e com o fluxo mitocondrial de acetil‑CoA, influenciando vias a jusante como a fosforilação oxidativa e a anaplerose. Perturbações genéticas ou a desregulação do metabolismo de corpos cetónicos envolvendo o OXCT1 têm sido associadas a fenótipos de disfunção metabólica, sustentando a sua utilização como alvo em estudos de metabolismo mitocondrial e deteção de nutrientes.

SCOT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de OXCT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SCOT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus OXCT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição OXCT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SCOT. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus OXCT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SCOT no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SCOT em células tumorais com expressão de OXCT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.