Plásmido CRISPR de Activación (h) SCOT: sc-404705-ACT

El OXCT1 humano codifica la succinil-CoA:3-oxoácido CoA transferasa (SCOT), una enzima mitocondrial que cataliza el paso limitante de la utilización de los cuerpos cetónicos al convertir el acetoacetato en acetoacetil-CoA para su incorporación al metabolismo del acetil-CoA y del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). La actividad de SCOT conecta la cetólisis con la bioenergética celular, el equilibrio redox y la flexibilidad metabólica en tejidos que oxidan cuerpos cetónicos durante el ayuno o ante una alta demanda energética. La función de OXCT1 está integrada con la oxidación de ácidos grasos y el flujo mitocondrial de acetil-CoA, influyendo en vías posteriores como la fosforilación oxidativa y la anaplerosis. La perturbación genética o la desregulación del metabolismo de los cuerpos cetónicos que involucra a OXCT1 se ha asociado con fenotipos de disfunción metabólica, lo que respalda su uso como diana en estudios de metabolismo mitocondrial y detección de nutrientes.

SCOT El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de OXCT1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SCOT El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus OXCT1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional OXCT1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SCOT. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo OXCT1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SCOT en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SCOT en células tumorales con expresión de OXCT1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.