SC35 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417676-ACT

Humanes SRSF2 (SC35) kodiert einen serin-/argininreichen Spleißfaktor, der an prä‑mRNA bindet und die Auswahl von Spleißstellen, die Exon-Definition sowie die Kopplung von Transkription und RNA-Prozessierung koordiniert. SC35 ist an der Assemblierung des Spleißosoms beteiligt und beeinflusst alternative Spleißprogramme, die den Zellzyklus, DNA-Schadensantworten und Differenzierung mitprägen, indem es die Isoform-Zusammensetzung über regulatorische Gen-Netzwerke hinweg moduliert. Eine Störung der SRSF2-Aktivität kann transkriptomweite Spleißmuster neu verdrahten und dadurch Proteindomänen-Zusammensetzung sowie die Vernetzung von Signalwegen verändern. Eine fehlregulierte SRSF2-Expression oder -Funktion ist mit aberranten RNA-Prozessierungs-Signaturen verbunden, die in mehreren krankheitsrelevanten zellulären Zuständen beobachtet werden, wodurch es ein nützlicher Knotenpunkt für mechanistische Studien zu spleißabhängigen Phänotypen ist.

SC35 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SRSF2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SC35 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SRSF2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SRSF2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SC35-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SRSF2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SC35-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SC35-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SRSF2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.