SAV1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402600-ACT

A SAV1 humana (proteína 1 contendo domínio WW da família Salvador) é um componente estrutural central (scaffold) da via supressora tumoral Hippo, que coordena a sinalização das quinases MST1/2 e LATS1/2 para restringir programas transcricionais conduzidos por YAP/TAZ. Ao promover a retenção citoplasmática e a degradação/reciclagem de YAP/TAZ dependentes de fosforilação, a SAV1 ajuda a regular a inibição por contato, o controle da proliferação, a apoptose e a homeostase tecidual. Alterações na expressão de SAV1 ou disfunções da via Hippo têm sido associadas a crescimento celular desregulado e a estados alterados de diferenciação em múltiplos contextos relevantes para doenças, particularmente aqueles caracterizados por atividade aberrante de YAP/TAZ. Assim, a SAV1 é amplamente estudada em vias que se cruzam com a dinâmica do citoesqueleto, a polaridade celular, a mecanotransdução e o controle do tamanho de órgãos.

SAV1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SAV1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SAV1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SAV1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SAV1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SAV1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SAV1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SAV1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SAV1 em células tumorais com expressão de SAV1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.