RyR CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401470-ACT

Das menschliche Gen **RYR1** kodiert den Ryanodinrezeptor (**RyR1**), einen tetrameren Ca²⁺-Freisetzungskanal des sarko-/endoplasmatischen Retikulums, der Membrandepolarisation mit einer schnellen intrazellulären Kalziummobilisierung koppelt. Von RyR1 ausgelöste Ca²⁺-Transienten regulieren die Erregungs‑Kontraktions‑Kopplung, die calciuminduzierte Calciumfreisetzung sowie nachgeschaltete Signalwege, die den mitochondrialen Stoffwechsel, die Zytoskelettdynamik und calciumabhängige Transkriptionsantworten prägen. Die Aktivität von RYR1 wird streng durch luminales Ca²⁺, den Redoxzustand und akzessorische Proteine wie FKBP12, Calmodulin sowie Triadin-/Junctin-Komplexe kontrolliert. Eine gestörte Kanal-Gating-Regulation von RyR1 und eine abnorme Ca²⁺-Homöostase stehen mit Pathophysiologie der Skelettmuskulatur in Zusammenhang und werden häufig im Kontext der Anfälligkeit für maligne Hyperthermie und kongenitale Myopathien untersucht.

RyR-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RYR1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RyR-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RYR1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RYR1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RyR-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RYR1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RyR-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RyR-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RYR1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.