RyR CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402986-ACT

Das humane Gen **RYR2** kodiert den Ryanodinrezeptor 2 (RyR2), einen großen Ca²⁺-Freisetzungskanal des sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulums, der die Erregungs‑Kontraktions‑Kopplung koordiniert, indem er zytosolische Calciumtransienten formt. Die RyR2-Aktivität integriert Signale aus den cAMP/PKA‑ und CaMKII‑Signalwegen und steht in Wechselwirkung mit der calciuminduzierten Calciumfreisetzung, dem mitochondrialen Stoffwechsel und nachgeschalteten Transkriptionsprogrammen. Störungen der RYR2-Expression oder der Kanalregulation beeinträchtigen die Ca²⁺-Homöostase und fördern abnorme Calciumwellen sowie veränderte elektrophysiologische Signalgebung in Kardiomyozyten. Eine RyR2-Dysfunktion ist mit erblichen und erworbenen kardialen Rhythmusphänotypen verknüpft und stellt damit einen zentralen Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Calciumhandhabung und zu zellulären Stressantworten dar.

RyR-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RYR2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RyR-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RYR2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RYR2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RyR-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RYR2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RyR-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RyR-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RYR2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.