Plasmide CRISPR d'Activation (m) Rubicon: sc-432438-ACT

La souris 1700021K19Rik code Rubicon (protéine contenant un domaine RUN et un domaine riche en cystéines, interagissant avec Beclin 1), un régulateur du trafic membranaire qui module l’autophagie et la maturation endolysosomale. Rubicon est surtout connu pour freiner la fusion autophagosome–lysosome via des interactions avec le complexe PI3K de classe III Beclin 1–VPS34, et pour influencer la phagocytose associée à LC3, façonnant ainsi la dégradation lysosomale, l’inflammation et les réponses cellulaires au stress. En contrôlant le flux au sein des voies autophagiques et phagocytaires, Rubicon peut affecter le contrôle qualité des mitochondries, la défense antimicrobienne et les programmes de production de cytokines pertinents pour la neurodégénérescence, les dysfonctions métaboliques et les pathologies à médiation immunitaire. Ces fonctions font de Rubicon un nœud utile pour analyser comment le trafic vésiculaire et le renouvellement dépendant des lysosomes gouvernent l’homéostasie dans divers types cellulaires murins.

Rubicon Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de 1700021K19Rik sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rubicon Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus 1700021K19Rik dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription 1700021K19Rik, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rubicon. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus 1700021K19Rik natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rubicon au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rubicon dans les cellules tumorales présentant une expression de 1700021K19Rik silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.