robo1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402263-ACT

ROBO1 kodiert den Roundabout-Leitungsrezeptor 1 (Robo1), einen Transmembranrezeptor für SLIT-Liganden, der über die SLIT–ROBO-Signalgebung die Axonführung, neuronale Migration und Gewebemusterbildung reguliert. In menschlichen Zellen beeinflusst ROBO1 über nachgeschaltete Signalwege der Rho-Familie von GTPasen die Zytoskelettdynamik und die Zellmotilität und wirkt sich damit auf Prozesse wie gerichtete Migration und Grenz-/Boundary-Bildung aus. Eine fehlregulierte ROBO1-Aktivität oder -Expression wurde mit abweichender entwicklungsbiologischer Signalgebung und veränderten Programmen der Zellinvasion in Verbindung gebracht, wodurch ROBO1 für Studien zu neuroentwicklungsbiologischen Mechanismen und zur Tumorbiologie relevant ist. ROBO1 wird außerdem als Marker und funktioneller Knotenpunkt in Untersuchungen von Signalkaskaden für Leitmoleküle sowie deren Crosstalk mit Wachstumsfaktor- und Adhäsionssignalwegen verwendet.

robo1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ROBO1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

robo1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ROBO1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ROBO1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen robo1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ROBO1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von robo1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des robo1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ROBO1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.