RADX Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409991-ACT

O CXorf57 humano codifica a RADX, um fator de ligação a DNA de fita simples que regula a estabilidade da forquilha de replicação e coordena a resposta celular ao stress de replicação. A RADX contrabalança a atividade da RAD51 em forquilhas estagnadas para limitar recombinações aberrantes, ajudando a preservar a integridade do genoma durante a fase S e em condições de dano no DNA. Pelas suas funções na replicação do DNA, no controlo da recombinação homóloga e na sinalização de checkpoints, a RADX é relevante para estudos de instabilidade cromossómica e de processos mutacionais que resultam de proteção defeituosa da forquilha. A desregulação da função da RADX tem sido associada a alterações na dinâmica de replicação e na escolha de vias de reparação do DNA, tornando-a um ponto útil para dissecar mecanismos de manutenção do genoma.

RADX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CXorf57 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RADX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CXorf57 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CXorf57, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RADX. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CXorf57 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RADX no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RADX em células tumorais com expressão de CXorf57 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.