RADX CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409991-ACT

Humanes CXorf57 kodiert RADX, einen einzelsträngigen DNA-bindenden Faktor, der die Stabilität von Replikationsgabeln reguliert und die zelluläre Antwort auf Replikationsstress koordiniert. RADX wirkt der RAD51-Aktivität an arretierten Gabeln entgegen, um abweichende Rekombinationsereignisse zu begrenzen, und hilft so, die Genomintegrität während der S-Phase und unter Bedingungen von DNA-Schäden zu bewahren. Aufgrund seiner Funktionen in der DNA-Replikation, der Kontrolle der homologen Rekbination und der Checkpoint-Signalgebung ist RADX für Studien zur chromosomalen Instabilität und zu Mutationsprozessen relevant, die aus einem defekten Gabelschutz entstehen. Eine dysregulierte RADX-Funktion wurde mit veränderter Replikationsdynamik und einer veränderten Wahl von DNA-Reparaturwegen in Verbindung gebracht, was RADX zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung von Mechanismen der Genomstabilität macht.

RADX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CXorf57-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RADX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CXorf57-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CXorf57-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RADX-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CXorf57-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RADX-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RADX-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CXorf57-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.